细胞研究的光学显微成像

　　光学显微镜迄今已有近500年的历史。随着透镜质量的提高,新衬度机理的发展及激光技术的采用,显微镜的功能越来越强。相继出现了近场扫描显微镜,荧光成像显微镜,图像恢复显微镜及荧光相关显微镜等,它们已成为研究细胞和亚细胞结构不可缺少的工具。

　　1　近场显微镜

　　传统的光学显微镜分辨率受衍射极限的限制,理论上可达到λ/2,实际上往往只达到λ的大小。用来研究细菌和细胞,曾给生物学和医学带来革命,但不能发现和研究具有纳米尺寸的细胞成分,如DNA。

　　1928年,辛格(E H Synge)在与爱因斯坦交谈时首次提出一种新型显微镜。其中决定分辨率的部分不包括透镜,仪器的光源通过微孔照明被观察的样品,光点在样品上扫描。如果孔的直径小于照明光的波长,并保持与样品的距离在几个纳米范围(近场),则显微镜的分辨率极限将主要由孔的直径决定,而不受衍射极限的制约。遗憾的是,当时还不具备建造近场光学显微镜的技术。

　　1982年,随着扫描隧道显微镜(STM)的发明,在样品表面几纳米内进行灵敏探测成为可能。1984年,IBM的工作人员在类STM显微镜中采用镀金属膜的玻璃光导管制造出第一台近场扫描光学显微镜(NSOM)。此后几年里,人们建造了很多NSOM,但由于当时玻璃光导管的光传输效率只有10-7~10-8量级,从而严重限制了这类仪器的实际应用。直到1991年,贝尔实验室的研究人员发明了用绝热方法控制的光纤光学探测器,将光传输效率提高了100~1000倍,才使NSOM真正进入实用阶段。

　　从1992年起,贝兹格(E Betzig)和焯特曼(JTrautman)等人先后在《科学》和《自然》杂志上发表文章,证明用荧光近场扫描显微镜可探测单荧光分子和独立荧光分子的光谱,分辨率可达λ/20,两年后,第一台可进行荧光成像的商用NSOM面世。

　　2　共焦显微镜和双光子显微镜

　　荧光显微术作为用光学方法研究生命过程的一种重要技术如今已十分普及,但它有很大的局限性。在传统的荧光显微镜中,一个二色反射镜将激励光束引进照明路径,长波长荧光发射通过一组波长滤波器,显微镜的像给出目标分子的二维分布。然而,由于细胞中的荧光源是三维分布的,不同深度及目标分子周围的荧光发射便增加了背景噪声,使图像变得相当模糊。

　　为消除噪声源,提高像的对比度,研究人员发展了共焦显微镜。在这种方法中,照明激光束被聚焦在感兴趣的细胞平面内,并在光源的共轭位置处设置针孔。虽然荧光响应可能在焦点外被诱发,但只有焦点处发射的光才能通过针孔并对成像有贡献。活细胞成像的一项更新的技术是多光子或双光子显微镜。其中,所选激光波长为激励靶中荧光染料吸收波长的两倍,即激励源的每个光子具有激励染料分子所需能量的一半。这样,单个光子对样品不发生作用;然而,如果两个光子在非常短的时间间隔内到达同一梁料分子,则将被其吸收并产生荧光。为了使两个光子几乎同时照到细胞中的目标分子,需要有足够强的吸收。但由于吸收截面与光强平方成正比,而光强与光点半径平方成反比,则激励随光点半径的4次方变化,激励区被限制在光点周围很小体积内。由于荧光发射来自单点,故双光子显微镜不再需要针孔。能量的定位吸收也使不影响其功能情况下的细胞成像变得容易。