实时荧光定量PCR仪中荧光检测装置的设计

　　0　引　言

　　聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)是一种在体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术,其原理类似于天然DNA的复制,是体外酶促反应选择性地合成特异性DNA的一种方法[1]。实时荧光定量PCR的反应通过添加荧光染料,由高温热变性、低温复性和适温延伸组成一个周期,循环进行,使DNA片段得以迅速扩增。在整个循环过程中,对产物进行标记监控,利用荧光检测装置得到实时荧光量[2]。在实时荧光PCR仪的荧光检测装置中,由于生物样品的特性,荧光染料所产生的荧光信号一般是很微弱的,甚至极其微弱[3]。因此,荧光检测装置中激发光源的稳定性和探测器的灵敏度是不容忽视的。

　　目前,各种实时荧光PCR仪中的荧光检测模块的区别主要在于激发光源和探测器。荧光仪器的激发光源多采用氙灯、汞灯、钨灯和激光器[4]。氙灯、汞灯和钨灯虽然辐射波段范围广,但在不同的波段输出信号强度不同。激光器是目前高性能荧光仪器主要使用的光源,单色性好,没有杂散光,但波长选择范围小,且价格及其昂贵。PCR仪光电检测模块的检测器主要有CCD和光电倍增管两类[5]。CCD的工作原理类似于数码相机,最大的优点就是可以同时扫描所有样品中的荧光信号,但灵敏度较低,而且,同时检测样品间的荧光信号存在干扰。光电倍增管具有灵敏度高、响应速度快、噪声系数小、动态范围宽等优点,特别适用于需要测量微弱或极微弱光信号的时间分辨荧光免疫分析仪器。

　　为了克服现有的荧光检测设备中激发光源发光强度不稳定,单色性差的不足,本文设计了一种基于LED光源的积分球式荧光检测装置。采用单色光LED与积分球相结合,使入射光源具有良好的单色性和平滑度,并且使用光电倍增管作为探测器,也保证了灵敏度和精确度。

　　1　系统整体设计

　　1.1　系统组成

　　基于LED光源的积分球式荧光检测装置由单色LED、激发窄带滤光片、积分球、荧光窄带滤光片、光电倍增管、样品和样品支架组成,系统结构如图1所示。

　　将待测的样品试管放入样品支架的定位孔中,由托盘支撑。LED发出的光线通过激发窄带滤光片滤去杂散光之后进入积分球,经过多次漫反射使光线的光强达到均匀的分布。当均匀的光线照射到样品试管上后,激发了荧光物质,使之产生荧光。样品产生的荧光通过荧光窄带滤光片照射到与积分球通光孔相连接的光电倍增管。因光电倍增管安放于试管的顶部,所以,荧光将不会受积分球漫反射的影响,直接进入光电倍增管,再通过光电倍增管后续电路,读出光强的信号。

　　1.2　激发光源