扫描电镜生物样品制备与观察

　　扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM )，与透射电子显微镜(TEM)有很多相似之处，它能够直接观察表面结构和形态，观察样品面积大，样品制备较TEM简单，上镜观察时可前后、左右旋转样品，可作三维观察，样品图像立体感好，分辨率介于光学显微镜和TEM之间，SEM数码图像资料远较TEM质量高，只是分辨率达不到TEM倍率。它是组织学、细胞学和细菌观察的有力工具川。以下是我工作的一点体会。

　　一、大型样品制备(组织、骨骼、牙齿)

　　大多数生物样品水分较大，较柔软，易被破坏，不能直接用SEM观察，一般标本均须取材、固定、组织导电染色、脱水、干燥、镀膜。

　　下面SEM图像(图1 -2)是小白鼠小肠、心组织，经过缓冲液清洗后，用2 -4%戊二醛固定置冰箱中冷藏1到2小时，后用双蒸水充分漂洗，用磷酸缓冲液再次清洗，酒精置换脱水，用400Io ,50% ,60% ,70% ,80% ,90%，95% ,100%的酒精，各浸泡十几分钟左右。将细胞组织内的水用乙醇等置换出来，然后用叔丁醇置换，浸泡2小时左右，再在冰箱冷冻室中冻结，放人」ED中抽干水分，直到大约S帕左右，让冷冻台升到室温，放气即可。然后镀膜(金或白金)上镜观(二次电子图像)。

　　骨骼及牙齿(见图3 -4)处理于净可以直接上镜观察，为了得到更好的二次电子图像增加反差，也可做一些前期处理后，镀膜观察【2】。

　　二、细菌样品的制备

　　细菌标本不同于上述的样品，它们需要经过复杂繁琐的处理过程，SEM是观察样品的表面结构，所以尽量减少固定处理引起的细胞收缩和变形。在固定液浓度、种类的选择应根据研究对象反复实践。主要讲一下细菌样品的制备。

　　取培养瓶或固体培养基中生长旺盛菌液，8000rpm离心3一5分钟，弃上清，倒人2一4%戊二醛固定，在冰箱中冷藏1到2小时用磷酸缓冲液再次清洗。用1%四氧化饿固定1一2小时，磷酸缓冲液再次清洗，乙醇脱水，用50% ,70% ,90%，各浸泡8分钟左右，然后100%的酒精脱水十几分钟。(注意:每一步都要离心，8000rpm，离心3一5分钟)，醋酸异戊醋浸泡半个小时以上或放置过夜。用六甲基二硅氨烷(HMDS)干燥3分钟。干燥好的菌体粉末用导电胶粘附喷金3一5分钟，上机镜检(图5-6)[3]。

　　经过这样处理的样品，其在扫描电镜观察图像真实的保存了样品的形体和特征。扫描电镜样品的制备与透视电镜有所不同，就是都要将样品脱水(冷冻扫描技术除外)，使用不同脱水剂的脱水效果和所需时间是不同的，如果就其普通样品观察，透射电镜的样品制备(细胞、细菌及病毒)负染观察(吸附、负染、烘干)要比扫描电镜样品制备简单得多，观察的也是样品表面形态，加速电压和电流远大于扫描电镜，能观察微细结构和形态达到纳米级，但没有立体感及层次变化。如果透射电镜作包埋切片样品，那就和扫描电镜没什么两样，都是很烦琐的过程。扫描电镜样品图像观察可获得三维立体图像，图像观察视野大、景深长、富有立体感。有些样品可以直接上镜观察(骨骼、牙齿、水分少的组织块等)，如果效果不好可以镀膜增加反差，达到其所要求的效果。