应用BACTEC-960仪进行DNA疫苗保护力评价的研究

      为探索结核病控制的新途径,利BACTECMGIT 960仪器分析动物实验模型主要脏器的结核分枝杆菌(MT)生长情况,以观察MT的MPT64,ESAT6质粒DNA疫苗预防结核病的效力。

　　1　材料与方法

　　1·1　材料

　　1·1·1　实验动物BALB/C小鼠由北京药检所动物中心提供。

　　1·1·2　MT强毒株(H37RV)由中国药品生物制品鉴定所提供。

　　1·1·3　质粒JW4303-MPT64和JW4303-ESAT

　　6重组表达质粒,宿主菌大肠杆菌DH5a由本院研究室提供,卡介苗由成都生物制品研究所提供。

　　1·1·4　BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养仪及其相关试剂由美国BD提供。传统培养基(7H10)由本室自制。

　　2　实验方法

　　6~8周龄雌性的BALB/C小鼠38只(购于北京药检所动物中心),分为五组。A组6只,双侧胫前肌各注射生理盐水0·1ML; B组6只,缓慢注射50ug/50ul载体质粒;C组6只,注射卡介苗0·1ML;D组10只,缓慢注射50ug/50ul重组质粒JW4303-MPT64 DNA;E组10只,注射重组质粒JW4303-ESAT6 DNA(方法同上)除C组外,其他四组分别于0,3,6周各免疫3次。

　　用H37RV MT强毒株(5×106CFU/ML)在9周时攻击小鼠。每只注射0·5ml于小鼠腹腔内。攻击一个月后,将每组前3只小鼠杀死。用75%乙醇浸泡小鼠20分钟,开腹取出肺、肝、脾。用无菌生理盐水冲洗,然后放入组织研磨器内研磨。

　　取研磨好的组织悬液0·1ml加入到0·9ml生理盐水中混匀,取0·1ml接种于7H10培养管中进行普通培养,30天时进行菌落记数。同时,取0·5ml接种于BACTEC MGIT 7H9培养管中,加入0·8ml添加剂,放入BACTEC MGIT 960培养仪内进行培养,每日观察培养结果,需培养42天后方可发出阴性结果。各组剩余的小鼠被攻击两个月后,将其全部杀死,重复上述操作步骤。

　　淋巴细胞转化试验。取小鼠脾研磨好的组织悬液,加入淋巴细胞分离液,离心后,吸取淋巴细胞层,与适度PHA混合,置37℃培养72小时。取培养的淋巴细胞涂片,染色、镜检。根据细胞大小、核与胞质的比例、胞质的染色性质和核结构以及有无核仁等情况,分别计数转化细胞(包栝大淋巴细胞、过渡型母细胞、核丝分裂相细胞)和小淋巴细胞,以百分率报之。

　　3　统计学方法

　　在进行淋巴细胞转化试验时,我们采用对比试验的统计试验方法。采用的统计量为

　　4　结　果

　　MT H37RV强毒株攻击一个月的小鼠肺、脾、肝培养结果:样本最快检出时间为6天,90%阳性样本检出时间为7~13天,最迟检出时间为40天,41~42天均无阳性样本检出。小鼠肺、脾、肝用BACTEC-960培养的每天GI(生长指数)平均值如图1所示。手工培养30天报告培养结果。A,B,C,D,E组的淋巴细胞转化率(%)平均值分别为54·2%;52·7%;